Das Spektralphotometer

Um zu erklären, was ein Spektralphotometer ist, wie es funktioniert und wofür man es einsetzen kann, sollen ersteinmal einige Grundlagen dargestellt werden.

Was ist Licht?

Licht besteht  im wissenschaftlichen Sinn aus nichts anderem als elektromagnetischen Wellen. Elektromagnetische Wellen (em-Wellen) sind Wellen, die aus einer Überlagerung zwischen einem magnetischen Feld (sog. B-Feld) und einem elektrischen Feld (sog. E-Feld) zustandekommen und im Raum eine dreidimensionale Ausrichtung haben. Je nachdem, wie schnell die einzelnen Wellenberge aufeinanderfolgen haben einzelne em-Wellen eine charakteristische Frequenz (f) bzw. eine dazugehörige Wellenlänge (). Die em-Wellen breiten sich, daher auch der Name, mit der Lichtgeschwindigkeit c aus, die ungefähr 300000 m/s beträgt. Je nachdem in welchem Bereich Wellenlänge bzw. Frequenz sind, befinden sich die em-Wellen im (für den Menschen) unsichtbaren Bereich oder im (für den Menschen) sichtbaren Bereich. Wenn die Wellenlänge zwischen ca. 400 und 700 Nanometer liegt, befindet sie sich im sogenannten sichtbaren Spektrum. Wie aus dem nächsten Bild entnommen werden kann, liegt die Wellenlänge 400 nm beim Übergang aus dem ultraviolette (UV) ins violette Licht.

Wenn man die Wellenlängenzahl erhöht, durchfährt man den ganzen Regenbogen bis ca. 700 nm in den roten Bereich. Unterhalb von 400 nm und überhalb von 700 nm kann das menschliche Auge die em-Wellen nicht mehr als Licht wahrnehmen (Ultraviollettes Licht (UV): <400 nm; Infrarotes Licht ( IR): >700 nm).

Wie kann man diese Erscheinung nun in der Chemie einsetzen?

Bestimmte chemische Substanzen, bzw. einzelne Atomgruppen oder Bindungen sind nun in der Lage Licht bestimmter Wellenlänge zu absorbieren (=verschlucken). Bei manchen Substanzen liegt die Wellenlänge im grünen Bereich (z.B. bei 540 nm), bei anderen eher im roten Bereich (ca. 650 nm). Wieviel des eingestrahlten Lichts nun von einer Probe absorbiert wird hängt sowohl von der eingesetzten Substanz ab, als auch von der Anzahl der bestrahlten Moleküle.

Um diese Erscheinungen zu nutzen, kann sich der Chemiker oder Biochemiker eines Photometers oder Spektralphotometers bedienen.

Das Prinzip ist im folgenden Bild gut erkennbar:

Eine Lichtquelle strahlt weißes Licht aus, das eine Mischung aus allen im Spektralbereich vorhandenen em-Wellen ist. Durch die erste Blende wird aus dem kugelförmig ausgestrahlten Licht ein schmales Lichtbündel herausgenommen. Dieses Bündel ist noch ein polychromatischer Lichtstrahl, das heißt aus sämtlichen em-Wellen unterschiedlicher Frequenzen zusammengesetzt. Um nun für die Messung einen monochromatischen Lichtstrahl (em-Welle mit einer Frequenz) zu bekommen, wird der Lichtstrahl durch ein Prisma geleitet. In diesem werden die Wellen abhängig von ihrer Wellenlänge unterschiedlich stark gebrochen, d.h. sie treten in einem unterschiedlich großem Winkel aus dem Prisma wieder aus. Dabei werden em-Wellen mit großen Wellenlängen (rotes Licht) schwach abgelenkt und em-Wellen mit kleinen Wellenlängen (blaues Licht) werden stark abgelenkt. Auf diese Art und Weise hat man schon eine Trennung der polychromatischen Strahlung erreicht. Aber wie kann man nun einen monochromatischen Lichtstrahl herausfiltern? Dazu dient die zweite Blende. Durch ihre geringe Öffnung gelingt es, nur einen Lichtstrahl einer bestimmten Frequenz - also monochromatisches Licht - durchzulassen. Dieser Lichtstrahl kann nun durch eine Glasküvette, die die zu untersuchende Probe enthält, geschickt werden. Je nachdem, welche Substanz und wieviele Moleküle der Lichtstrahl durchläuft, wird er unterschiedlich stark absorbiert. Anschließend trifft der Lichtstrahl (durch eine Blende von Streuungen "gereinigt") auf einen Detektor - meist eine Photozelle, die die Intensität des auftreffenden Lichts mißt und an das Anzeigeinstrument weitergibt.

Die Frage wie stark der Lichtstrahl nun absorbiert wird drückt sich in mehreren Größen aus. Jedes Molekül besitzt eine stoffspezifische Absorptionskonstante , die angibt, wie stark diese bestimmte Molekülart bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Um die Absorpption nun verwerten zu können muß man natürlich auch wissen, wieviele Moleküle durchstrahlt wurden, was sich aus der Konzentration des Moleküls (c) und der durchstrahlten Küvettendicke (d) leicht errechnen läßt.
Aus vielen Messungen wurde aus den bekannten Parametern das sog. Lambert-Beersche Gesetz hergeleitet:

Nun kann man das Ergebnis auf verschiedene Weise angeben und verwerten:

1. Die Absorption gibt an, wieviel vom eingestrahlten Licht absorbiert worden ist:

2. Die Transmission gibt an, wieviel des eingestrahlten Lichts durch die Probe hindurchgegangen ist, das heißt das Verhältnis aus durchgelassener Intensität (I) und eingestrahlter Intensität (Io):

Je nachdem, ob man nur überprüfen muß, ob ein Grenzwert nicht überschritten wird, oder ob man eine genaue Konzentration herausfinden möchte wählt man zwischen Absorptions- (=Extinktions-) oder Transmissionsmodus.
 

Anwendungen der Spektralphotometrie

Prinzipiell gibt es nun zwei Möglichkeiten ein Spektralphotometer für die Analyse einer geeigneten Probe zu benützen:

1.Es wird ein Spektrum aufgenommen, bei dem die Probe nicht verändert wird und die Wellenlänge das ganze Spektrum "durchläuft". Es werden Messungen von Wellenlängen im blauen (ca. 400 nm) bis in den roten Bereich (ca. 700 nm) durchgeführt, wobei  die Wellenlänge bei jeder Messung um z.B. 5 nm variiert wird. Daraus erhält man nun ein Absorptionsspektrum einer Substanz. Aus diesem ist leicht zu erkennen, daß eine Molekülart bei unterschiedlichen Wellenlängen unterschiedliche Absorptionskonstanten hat. Diese können mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetzes berechnte werden. Aus dem Verlauf des Spektrums kann man auf die Substanz selbst schließen. Das Absorptionsspektrum macht also eine Identifizierung des Produkts möglich.

Ein Beispiel für so ein Spektrum kann man in der nächsten Abbildung sehen.

Hier wurde ein Absorptionsspektrum für das Fantasymolekül ElHaRDt erstellt. Wie man deutlich erkennen kann absorbiert es bei 465 nm fast das gesamte Licht und läßt bei 440 nm fast das gesamte Licht durch. Andere Konzentrationen der Probe würde zwar unterschiedliche Absolutwerte liefern, der Verlauf des Spektrums bliebe jedoch gleich.
Bei einem anderen Molekül gäbe es möglicherweise nur einen Peak, oder 3 spitze Absorptionspeaks, etc.

2. Es wird ein Spektrum bei einer festen Wellenlänge durchgeführt. Gemessen wird am besten bei einer Wellenlänge , bei der die Substanz eine große Absorption besitzt, um eine große Auflösung zu bekommen. Aus der Größe der Extinktion und den anderen technischen Daten kann nun auf die Konzentration des Stoffes geschlossen werden. Auch hier bietet das Lambert-Beersche Gesetz die Grundlage.

Eine solche Messung wurde hier  durchgeführt:
Versuchsbedingungen

Bei dieser Messung wurden verschiedene Konzentrationen der gleichen Substanz bei einer konstanten Wellenlänge von 366 nm vermessen. Wenn man die einzelnen Meßpunkte verbindet kann man annähernd eine Gerade erkennen, was eine Bestätigung der Proportionalität im Lambert-Beerschen Gesetz bedeutet.
 

Weitere Anwendungen

Eine praktische Anwendung bietet natürlich auch die Kombination der beiden Methoden:
Zuerst wird die Substanz durch das charakteristische Absorptionsspektrum durch Vergleich mit Literaturspektren ermittelt und dann dessen Konzentration bei einer geeigneten Wellenlänge ermittelt.

In der Praxis trifft der Chemiker jedoch oft auf das Problem, daß er die Konzentration einer Substanz ermitteln möchte, die im sichtbaren Wellenlängenbereich leider nicht absorbiert.
Hier kann man sich mit einem intelligenten Trick behelfen. Man läßt die gewünschte Substanz vollständig mit einer weiteren Substanz reagieren, so daß ein Produkt entsteht, daß im sichtbaren Bereich absorbiert. Nun kann dieses Produkt ohne große Probleme mit dem Spektralphotometer vermessen werden.