Eine Anwendung der Hexokinase-Methode wird im folgenden Abschnitt aufgezeigt.
Es soll die Glucosekonzentration eines Apfels auf enzymatischem Weg
festgestellt
werden. Der Grund, warum gerade die Hexokinase-Methode ausgewählt
wird, be-
steht im wesentlichen aus zwei Aspekten. Einerseits ist die Methode
selbst sehr
präzise, zum anderen beeinträchtigen weitere Zucker, die
im Apfel vorhanden sind,
das Ergebnis nicht. Eine genauere Diskussion der Vor- und Nachteile
der einzelnen
Methoden wird im letzten Teil der Facharbeit ausgeführt.
2.3.1 Probenvorbereitung
Für die Messung werden dieselben Lösungen wie in 2.2.4.2 verwendet:
Pufferlösung, NADP+-Lösung, ATP-Lösung, sowie
die Enzymsuspension mit Hexo-
kinase (HK) und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6P-DH).
An Stelle der Glucosestandardlösung wird nun ein Apfelextrakt eingesetzt,
in dem die
Glucose des Apfels enthalten ist. Um diesen Extrakt herzustellen, wird
der Apfel
(m = 115,85 g) in einem Mixer unter zugabe von 200 ml Wasser zerkleinert,
so daß
ca. 310 ml zähflüssige Masse erhalten werden. 50 ml davon
werden zentrifugiert, um
die Lösung von grobem Zellmaterial zu befreien, und ergeben 43
ml Lösung. Dennoch
bleibt eine schwache Trübung bestehen, die durch Filtratrion beseitigt
werden kann.
Das fast klare Filtrat wird für die Analyse eingesetzt.
Da die Chemikalien nur für einen Glucosegehalt von 0,1 bis 1 g/l
bestimmt sind, wird
vor der Messung eine Verdünnungsreihe angesetzt, um die Größenordnung
der not-
wendigen Verdünnung zu erfahren. Daraus ergibt sich, daß
der Extrakt noch 1:10 ver-
dünnt werden muß (5 ml Extrakt auf 50 ml mit Wasser verdünnen).
Nun kann mit der eigentlichen Messung begonnen werden.
2.3.2 Versuchsdurchführung
In die Küvette werden 1,00 ml Puffer, 0,10 ml NADP+-Lösung
und 0,10 ml ATP-Lösung
gegeben. Dazu werden 0,05 ml der verdünnten Probelösung pipettiert
und die Extinktion
dieser Mischung im Photometer auf Null eingestellt. Nach 3 Minuten
werden der Lösung
0,02 ml der Enzymsuspension zugegeben, womit die Reaktion gestartet
wird.
In Abhängigkeit von der Zeit ergeben sich die Extinktionswerte:
| Zeit (in min) | 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 |
| Extinktion | 0,000 | 0,253 | 0,270 | 0,271 | 0,271 | 0,271 |
Für die Glucosemasse, die im Apfel enthalten ist, gilt die im Anhang
hergeleitete Beziehung:
Vges * F * Vk * E
m(Glucose) = M(Glucose) * ------------------------
Eo * d * Vp
| Vges | = 310 ml | Volumen des gesamten Apfelextrakts |
| F | = 10 | Verdünnungsfaktor |
| Eo | = 3444 cm2/mmol | molarer Extinktionskoeffizient von NADPH |
| d | = 1,0 cm | Schichtdicke der Küvette |
| Vk | = 3,22 ml | Gesamtvolumen in der Küvette |
| Vp | = 0,05 ml | in der Küvette eingesetztes Probevolumen |
| M(Glucose) | = 180 g/mol | Molmasse der Glucose |
| E | = 0,271 | Extinktion |
Demnach ist der Massenanteil der Glucose:
m(Glucose)
x = ---------------= 2,4 %
m(Apfel)