Neben vielen weiteren enzymatischen Bestimmungsmethoden wird die
sogenannte Hexokinase-Methode (HK) verwendet.
2.2.4.1 Grundprinzip der HK-Methode
Das Enzym Hexokinase setzt Hexosen und Adenosintriphosphat (ATP) zu
Hexose-6-phosphat und Adenosindiphosphat (ADP) um:
Reaktionsgleichung für Glucose:
Hexokinase
D-Glucose + ATP ----------------> G-6-P + ADP
| ATP | = Adenosintriphosphat |
| G-6-P | = Glucose-6-phosphat |
| ADP | = Adenosindiphosphat |
G6P-DH
G-6-P + NADP+ ----------------> D-Gluconat-6-phosphat
+ NADPH + H+
| NADP+ | = Nicotindiamid-adenin-dinucleotid-phosphat, oxidierte Form |
| G6P-DH | = Glucose-6-phosphatdehydrogenase |
| NADPH | = Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat, reduzierte Form |
Es entsteht der Reaktionsgleichung zufolge eine der Ausgangsmenge an
D-Glucose
äquivalente Stoffmenge NADPH, die mit dem Photometer bestimmt
werden kann,
da NADPH im Gegensatz zu NADP+ bei 340 nm ein Absorptionsmaximum
besitzt.
2.2.4.2 Durchführung
Zur Herstellung des Analysenpuffers wurden 14,0 g Triethanolamin*HCl
in 95 ml Wasser
gelöst und mit Natronlauge auf pH 7,6 , dem pH-Optimum der Enzym
reaktionen, einge-
stellt. Zudem wird eine NADP+-Lösung der Konzentration
10 mg/ml und eine ATP-Lösung
mit 300 g Adenosin-5-triphosphat-Dinatriumsalz und 300 mg Natriumhydrogencarbonat
(NaHCO3) in 6 ml Wasser angesetzt. Die beiden an der Reaktion
beteiligten Enzyme wer-
den in Form einer fertigen Enzymsuspension verwendet, in der 2 mg Hexokinase/ml
und
1 mg Glucose-6-phosphat-dehydrogenase/ml in einer 3,2 molaren Ammoniumsulfatlösung
vorliegen.
Anschließend werden 1,00 ml der Pufferlösung, 0,10 ml der
NADP+-Lösung, sowie
0,10 ml der ATP-Lösung in Küvetten pipettiert und gut durchmischt.
Von einer Glucose-
standardlösung mit Co= 1 mg/ml werden in eine Küvette 0,05
ml gegeben. Nachdem die
Lösung noch mit 1,95 ml Wasser auf 3,2 ml Gesamtvolumen (Lösung
1) versetzt wurde,
wird nach etwa 3 Minuten die Lichtmarke des Photometers auf die Extinktion
0 für diese
Lösung eingestellt. Nun kann mit der eigentlichen Messung begonnen
werden. Mit der
Zugabe von 0,02 ml der Enzymsuspension (HK + G6P-DH), wird die Reaktion
gestartet.
Die Extinktionen werden in Abständen von je 1 Minute gemessen.
Genauso wird einem 2. Ansatz verfahren, dessen Glucosekonzentration
doppelt so groß ist.
Nun werden in die Küvette 0,1 ml Standardlösung und 1,9 ml
Wasser gegeben (Lösung2);
die Messung wird wie oben ausgeführt.
2.2.4.3 Ergebnisse
Wenn sich nach einiger Zeit ein konstanter Extinktionswert eingesellt
hat, so ist zu erwarten,
daß die Extinktion der Lösung 2 den doppelten Betrag von
der der Lösung 1 besitzt, da
Lösung 2 mit der zweifachen Glucosekonzentration die zweifache
Lichtabsorption bewirken
müßte.
Wie im Diagramm deutlich wird, stimmt die Theorie mit der Praxis recht gut überein.
Die Extinktionsänderung der Lösung 2 beträgt 0,601 -
ungefähr das Doppelte der Änderung
der Lösung 1: 0,310. Auch hier liegt die Vermutung nahe, daß
Konzentration und Extinktion
direkt proportional zueinander sind.